前言
年齡相關(guān)性黃斑變性(age related macular degeneralion, AMD)是65歲以上老年人致盲的主要原因。AMD分為無新生血管生成的干性以及新生血管生成的濕性表現(xiàn)。濕性AMD患者發(fā)生CNV是導(dǎo)致視力喪失的最常見因素。本章將介紹CNV的造模方法。
部分造模方法
使用動物：小鼠、家兔、獼猴
【造模機(jī)制】：
激光誘導(dǎo)CNV模型是常見的方法。1979年，Ryan等首次采用高功率激光穿透Bruch膜制作出CNV動物模型。1989年，Dobi等第一次應(yīng)用647nm波長、120mW的氪激光可造成CNV模型。1998年，Tobe等將氪激光光凝術(shù)應(yīng)用于制作小鼠CNV模型，此后激光誘導(dǎo)CNV模型被普遍應(yīng)用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和治療方法的研究中。藍(lán)綠氬激光穿透力較弱，主要作用于視網(wǎng)膜內(nèi)層和RPE層。氪激光主要作用于RPE和脈絡(luò)膜內(nèi)層。激光誘導(dǎo)CNV模型的優(yōu)點(diǎn)在于與人類CNV疾病發(fā)生自然過程相似，但不同研究CNV模型成功率不同，與不同實(shí)驗(yàn)采用動物類型、激光種類及對觀察診斷CNV的標(biāo)準(zhǔn)不一有關(guān)。
【造模方法】：
1.小鼠 雙眼滴用復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳，腹腔注射1％戊巴比妥鈉(10ml/kg)麻醉小鼠，實(shí)驗(yàn)眼滴用醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠，眼前放置2cm×2cm蓋玻片，經(jīng)裂隙燈用532nm激光功率200mW，光斑直徑100m，曝光時(shí)間100毫秒，距視乳頭1.5-2.0PI左右位置以視乳頭為中心進(jìn)行光凝，其中行CNV模型鑒定和免疫熒光染色組小鼠光凝4~6點(diǎn)／眼；光凝后有氣泡產(chǎn)生標(biāo)志擊破Bruch膜， 記為有效點(diǎn)。
2.家兔 兔眼激光誘導(dǎo)模型在國內(nèi)應(yīng)用較為廣泛，優(yōu)點(diǎn)在于兔眼較之鼠眼大，易于模型實(shí)驗(yàn)操作與檢查。雙眼散瞳，眼表滴入表面麻醉。每只眼在全視網(wǎng)膜鏡下用氪激光，波長647nm，功率700~800mW，光斑直徑50µm，激光功率曝光時(shí)間0.05秒，在視乳頭及髓線下方光凝20個(gè)點(diǎn)，光斑間隔300µm。
3.獼猴 猴的視網(wǎng)膜及黃斑結(jié)構(gòu)與人類相似，眼球大小便于操作，具有熒光滲漏的特點(diǎn)，是用于臨床藥物篩選的首選模型。Ryan等利用氬激光，功率200~950mW，光斑直徑50~200µm，曝光時(shí)間0.1~0.5秒。
【模型特點(diǎn)】：
1.小鼠 常采用免疫組化技術(shù)應(yīng)用CD31標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞，在光疑后14天時(shí)CNV模型鼠的視網(wǎng)膜光激部位可見明顯的綠色熒光團(tuán)塊，表明新生血管形成，從而表示CNV模型誘導(dǎo)成功。
2.家兔 激光斑出現(xiàn)強(qiáng)熒光滲漏為CNV形成，第3~4周見穩(wěn)定的滲漏光斑，CNV發(fā)生率66.7％，滲漏率51.7％。光凝后3天即有少量光斑出現(xiàn)熒光滲涌，并逐漸增多，21天達(dá)高峰，并持續(xù)到光凝后56天。OCT顯示造模后7天少量光斑部位色素上皮層反射中斷，其下方局灶性高密度紅白色反射區(qū)呈團(tuán)塊狀、梭形或不規(guī)則形，邊緣為瘢痕形成的不規(guī)則強(qiáng)反射區(qū)，CNV出現(xiàn)；之后CNV逐漸增多，至21天各組達(dá)最多；晚期部分CNV瘢痕化。熒光滲漏的計(jì)算[（熒光滲漏發(fā)生率＝出現(xiàn)熒光滲漏的激光點(diǎn)數(shù)／所觀察的激光點(diǎn)數(shù)）×100％]。
3.猴 光凝猴視網(wǎng)膜出現(xiàn)新生血管以及眼底血管熒光造影觀察出現(xiàn)血管滲漏，為成功建立了CNV動物模型。但相比鼠類和家兔，非人類靈長類的CNV滲漏率較低約30％，三度損傷約占70％，四度損傷約為20％~40％。實(shí)驗(yàn)組應(yīng)選用8~10只猴才能得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果。因?yàn)楹飦碓瓷?，費(fèi)用高，飼養(yǎng)較困難，模型制作需4周以上，因此應(yīng)用受限。
【模型評估和應(yīng)用】：
小鼠激光誘導(dǎo)CNV模型的成功率約為80％，兔的激光誘導(dǎo)CNV模型的成功率約50％，而選用非人類靈長類動物激光誘導(dǎo)CNV模型的成功率最低約30％。激光誘導(dǎo)CNV動物模型可模擬人類濕性AMD疾病，采用這種方法直接損傷脈絡(luò)膜，與人類CNV存在共同之處，對于研究濕性AMD的發(fā)病機(jī)制與治療方法有重要的臨床價(jià)值。
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